子痫前期是一种严重的妊娠合并症,是导致孕产妇及围产儿死亡的主要原因之一

。目前,其病囚尚不明确。多认为其发病起源于胎盘的病理生理改变,尤其是胎盘

基底板的变化,继发性引起胎盘组织的缺血缺氧,而氧化应激状态扩散至孕妇体循

环,导致孕妇血管内皮细胞功能紊乱,凝血与纤溶系统失衡,血压升高、蛋白尿及多

脏器功能不全[1]。玻连蛋白(vitronectin,VN)作为黏附蛋白家族中的一员,具有

细胞黏附、促进凝血及免疫防御的功能。因而VN可能在重度子痫前期胎盘基底板

病理生理改变及其发病机制中起到重要作用。本研究通过检测重度子痫前期孕妇

胎盘基底板中ⅤN蛋白及mRNA的表达及凝血功能指标的变化,旨在探讨VN在重度子

痫前期发病中的作用,为重度子痫前期孕妇的临床监测及治疗提供新途径。
  资料与方法
  一、资料来源与分组
  随机选择⒛10年3月-2011年12月吉林大学白求恩第二医院产科住院分娩的重度

子痫前期孕妇63 例,其中17例早发型重度子痫前期孕妇为早发型重度子痫前期组,

平均年龄(29± 6)岁,平均分娩孕周(32.7± 5.1)周;16例晚发型重度子痫前期孕

妇为晚发型重度子痫前期组,平均年龄(29±5)岁,平均分娩孕周为(38.6±l.7)周;

重度子痫前期的诊断及分类标准参照八年制全国统编教材《妇产科学》2版[2]。

早发型重度子痫前期孕妇发病于孕周前,晚发型重度子痫前期孕妇发病于孕34周
后。另选孕34周以前的健康孕妇,因胎儿心脏发育畸形等原因要求引产者15例为早

期对照组,平均年龄(28± 6)岁,平均孕周为(298± 37)周;孕34周以后的健康孕妇

15例为晚期对照组,平均年龄为(30± 4)岁,平均孕周为(385± 14)周。各组均
排除合并有慢性高血压、糖尿病、肝肾疾病、甲状腺功能亢进、感染等;各组孕妇

均为单胎妊娠,分娩方式除早期对照组中7例经水囊引产外,其余均为硬
膜外阻滞下剖宫产分娩。该研究获吉林大学白求恩第二医院伦理委员会批准,标本

采集均有孕妇的知情同意。
  二、方法
  1.胎盘组织标本采集:待胎盘娩出后立即于无菌条件下,随机取距脐带2cm、肉眼

观胎盘梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区及远离梗塞区的组织分别各3块,大约

10cm× 1.0cm× 0,1cm。1块标本立即用生理盐水漂洗,去除血液并吸干水分,修剪

标本后重约50mg,置于-80℃ 冰箱中待测。1块标本置入4%甲醛溶液中,固定24h,常

规石蜡包埋、切片、烤片,常温下储存待行免疫组化检测。
  2血浆标本采集:孕妇于人院时、治疗前空腹抽取静脉血2 ml,2500 r/min离心

10min,4℃ 。取血浆批量上机待测凝血功能。
  3.免疫组化法检测VN蛋白表达:兔抗人VN单克隆抗体购自美国abcam公司,工作浓

度⒈9~O0。采用北京中杉金桥生物技术有限公司生产的PV-90O0免疫组化试剂盒对

胎盘基底板中VN蛋白进行免疫染色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照

,以已知阳性切片作为阳性对照。用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(购自北京中杉

金桥生物技术有限公司)显色,苏木素轻度复染,系列乙醇脱水,二甲苯透明,封片,

显微镜下观察并拍照。免疫组化结果判定:采用image-pro plus6.0软件图像分析

系统对组织切片进行图像分析,同一组织在高倍镜下分别取5个不同的视野进行吸

光度(A)测定,以代表胎盘基底板中VN蛋白的表达水平;于胎盘基底板梗塞灶中心、

梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区分别于高倍镜下取不同的视野进行平均A测定

,以代表VN蛋白的表达水平。
  4.RT-PCR技术检测VN mRNA表达:胎盘组织标本中加人蛋白裂解液1ml,浆,TRIzol

法提取总RNA。按RT-PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司产品)操作步骤提取cDNA,

用相关引物扩增得到目的片段。引物设计按文献[3],由上海生工生物工程技术服

务有限公司合成。VN引物序列(254bp)上游:5′ -CCTTCACCGACCTCAAGAAC-3′ ,下

游:5′ -GAAGCCGTCAGAGATAmTCG-3′ 。 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内

参照,其引物序列(177bp)⊥1游:5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′,下游: 5′ -

CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′ 。 反应条件:反应体系25 ul,94℃反应30s,55℃ 反

应30s,72℃ 延伸1 min。反应30个循环。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳,并于凝

胶成像系统中紫外线透射成像。以VN与GAPDH条带的A比值表示VNmRNA的相对表达

水平。
  5.凝血功能检测:取枸橼酸钠抗凝的外周血2 ml,2000 r/min离心10min,取血浆

上机测定孕妇的凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(RIb)

并计算国际标准化比率(INR)。
  6.相关性分析:对早发型重度子痫前期组和早期对照组孕妇的凝血功能检测的异

常指标,与VN表达水平进行相关性分析。

  三、统计学方法
  采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。组间比较采用扌检验,对数据进行正态性

检验和方差分析,多个独立样本均数比较采用单因素方差分析,最小显著差(LSD)法

进行多组间多重比较,相关性分析用spearman相关分析法。

  结 果
  一、各组胎盘基底板中ⅤN蛋白的定位表达
  4组胎盘基底板中均可检测到VN蛋白的表达,在早期及晚期对照组,VN蛋白主要表

达于部分形态正常的绒毛外滋养细胞(extravilloustrophoblasts,EVT)胞膜,胞质

或胞核中也有一定表达。在早发型及晚发型重度子痫前期组,VN蛋白表达的部位较

为广泛,于梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区的细胞滋养细胞中均

有表达,EVT胞膜、胞质中也有一定表达。尤其在梗塞灶中心非细胞结构坏死组织

中呈高表达,而在远离梗塞区组织中呈弱表达。见图1~4。
  二、各组胎盘基底板中ⅤN蛋白表达水平
  早发型重度子痫前期组胎盘基底板中VN蛋白表达水平最高,为0.152±0,019,晚

发型重度子痫前期组为0.113±0.023、晚期对照组为0.0955±0.014、早期对照组

为0.055±0.010,各组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。VN蛋白在胎盘基

底板梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区组织及远离梗塞区组织中的表达水平依

次逐渐降低,分别横向比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。各组梗塞灶中心、梗

塞灶边缘、近梗塞区组织及远离梗塞区组织中ⅤN蛋白表达水平分别纵向比较,差

异均无统计学意义(P>0.05 )。见表1。
  三、各组胎盘梗塞灶中心及其周围组织中VNmRNA表达水平
  各组胎盘梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区组织、远离梗塞区组织中均可检

测到VN mRNA表达,横向比较,早发型重度子痫前期组及早期对照组的梗塞灶中心VN

mRNA表达水平较远离梗塞区组织升高,差异有统计学意义(P<0.05)。纵向比较,各

组相同部位间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
  四、各组孕妇凝m功能指标水平
  早发型重度子痫前期组PT明显缩短,与早期对照组比较,差异有统计学意义

(P<0.05)。而各组APTT、FIb及INR分别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3

。
  五、早发型重度子痫前期组及旱期对照组VN表达水平与PT的相关性分析
  早发型重度子痫前期组胎盘VN表达水平与PT呈显著负相关(r=-0.612,P<0.05);

而早期对照组胎盘VN表达水平与PT无相关性(r=0489,P>0.05)。

  讨论
  一、胎盘基底板巾VN的表达与子痫前期胎盘梗塞的关系随着胎盘的娩出,大多数

子痫前期孕妇的临床症状逐渐消失。由此,越来越多的研究者将子痫前期研究的目

光投向了胎盘。胎盘功能的建立依赖于良好的胎盘形态和丰富的血液供应[4],这

是维持妊娠成功的关键。目前认为,胎盘功能异常及其缺氧导致了作用于孕妇向管
的可溶性生物囚子的生成,由此引起了孕妇血管内皮功能障碍和子痫前期的一系列

临床症状发生[5]。近年来,对子痫前期孕妇的胎盘病理检查发现,胎盘血管内大量

纤维素的沉积造成胎盘螺旋小动脉的栓塞,这与维持正常血液灌流的凝血、抗凝系

统失衡有关。VN在国内翻译为外连素、体外连接蛋白、玻璃粘连蛋白或S蛋白,主

要参与细胞之间、细胞与细胞间质之问的黏附,这是通过黏附蛋白家族共同的精氨

酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)3肽结构来实现的,其特舁性受体就是整合素家族。目前

鲜见VN在子痫前期胎盘中表达的系统研究。本研究通过对胎盘基底板中VN蛋白表

达水平的检测,发现VN在早发型及晚发型重度子痫前期组、早期及晚期对照组孕妇

胎盘基底板的梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区的表达水平依次

逐渐降低。这些结果提示,胎盘发生梗塞后VN表达水平升高,一方面,VN通过其黏附

作用稳定了细胞外基质,减少了纤维蛋白的降解,为胎盘梗塞灶的纤维化提供了有

利条件,但这种纤维化则进一步影响了胎盘的灌注。另一方面,这样可以减少胎盘

梗塞灶内毒性物质及滋养细胞坏死碎片进入孕妇的血液循环,从而阻止其对孕妇血
管内皮及其他器官的损伤,减少临床症状的发生。因此,VN在胎盘梗塞区及近梗塞

区的高表达有利于胎盘损伤修复并对孕妇具有一定的保护作用。
  二、胎盘基底板中VN的表达与子痫前期孕妇凝血机制的变化
  本研究发现,在梗塞灶边缘、近梗塞区及早期梗塞灶的细胞滋养细胞及EVT胞膜

、胞质中VN呈强表达;在中期及晚期梗塞灶中心非细胞结构坏死组织中呈强表达。

在中期梗塞灶中心见坏死组织的滋养细胞残影,而胎儿血管完整,间隙内游离的红

细胞胞膜完整。在晚期梗塞灶中心可见坏死的绒毛残影及被VN抗体染色的纤维状

组织。这些结果提示,胎盘梗塞灶中的坏死细胞成分中存在VN,一方面可能参与了

局部的凝血和纤维化过程,另一方面可能游离进入孕妇血液循环,从而对健康妊娠

过程产生不利的影响。
  健康孕妇于孕晚期处于血液的高凝状态,同时抗凝功能和纤溶活性也相应增强,

两者保持着高水平的动态平衡,这有利于胎盘剥离后的止血。子痫前期孕妇血管内

皮细胞受到严重损伤,伴随着血小板活性和凝血功能显著增强,而抗凝功能和纤溶

功能降低,导致凝血-纤溶平衡失调,机体处于病理性高凝状态并具血栓形成倾向,

此是子痫前期重要的病理生理机制[7]。本研究通过检测重度子痫前期孕妇及健康

孕妇的外周血凝血功能指标(PT、APTT、FIb及INR)时发现,早发型重度子痫前期组

PT比早期对照组明显缩短,其他指标变化的程度较轻。PT代表外源性凝血系统的激

活程度,提示早发型重度子痫前期组孕妇的血液呈高凝状态,这可能与外源性凝血

系统的激活有关。在本研究中,早发型重度子痫前期孕妇胎盘基底板中VN表达水平

升高,在梗塞灶萎陷的绒毛间隙中存在游离的VN染色颗粒,这些从胎盘坏死组织中

释放出来的VN可能进人孕妇体循环,起到促进凝血功能的作用,成为使孕妇凝血系

统与纤溶系统失衡的重要因素之一。
  VN在胎盘组织及孕妇血循环中的促凝机制可能与下列过程有关:(1)在血管壁受

损时,血管细胞外基质中的VN与血小板结合,在血管破损处黏附与聚集,从而起到止

血的作用。(2)VN能与抗凝血酶Ⅲ及凝血酶结合后形成复合物,一方面这种复合
物本身能被细胞表面的VN受体识别而被清除,另一方面,VN通过形成的复合物,暴露

肝素结合位点,与肝素结合后抑制其抗凝血功能,从而促进凝血并加速肝素从体内

清除。(3)子痫前期孕妇血小板的活化程度更加明显,且与病情的严重程度相关,
VN能通过自身的RGD结构与血小板膜糖蛋白结合,促进血小板的黏附,进而促进血小

板性血栓形成。(4)胎盘组织缺氧导致纤溶酶原激活抑制物1(PAI-1)水平升高[10]
,VN是PAI-1的辅助因子,两者相互结合而发挥抑制纤维蛋白溶解及减少细胞外基质

降解的作用,从而向凝盹和血栓形成方面转化。这一机制有待于进一步通过检测孕

妇血浆中VN水平的变化来证实。
  三、VN与子痫前期发病的关系
  1967年,首次在人血清中分离出VN,并证实其分布于各种组织的细胞外基质中。

过去认为,VN仅由肝细胞合成,然而有研究表明,在很多其他组织,如脑组织、脂肪

组织、心脏和骨骼肌组织等均可检测出大量VN mRNA,这提示VN也可以由非肝细
胞产生[11-12]。EVT是除细胞滋养细胞、合体滋养细胞之外的第3种滋养细胞,目

前认为它曲细胞滋养细胞演变而来,可以转化为合体滋养细胞,是两者之间的过渡

形式。本研究发现,胎盘基底板中存在VN mRNA表达,更进一步证实胎盘基底板存在

能够转录VN的功能细胞,免疫组化结果证实EVT就是这样的细胞。而在本研究中胎

盘梗塞灶边缘,早期梗塞灶中EVT高表达VN,提示胎盘缺氧可能是这种现象的促进因

素。这些表达VN的EVT可能是孕妇体内VN的来源之一。此外,胎盘梗塞灶中心坏死

细胞成分中存在VN高表达,提示这部分VN可能来源于坏死的滋养细胞中VN的释放,

可能是孕妇体内VN的又一来源。总之,本研究结果表明,ⅤN在重度子痫前期尤
其是早发型重度子痫前期孕妇胎盘基底板中表达水平明显升高,提示VN与子痫前期

发病相关。VN在胎盘梗塞区域及梗塞灶周围中间型滋养细胞中高表达,有利于胎盘

局部梗塞成分黏附、聚集、凝血及纤维化,这是一种对母儿有益的保护性机制。同

时也提示,可能来自胎盘梗塞灶坏死的滋养细胞释放的EVT所分泌的VN进入孕妇体

循环,引起血管内皮细胞损伤,外源性凝血系统激活,凝血与纤溶系统平衡失调,最

终导致子痫前期相关临床症状的发生。

   参 考 文 献
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(收稿日期:2012-07-03)
(本文编辑:侯存明)